丝状真菌rRNA(核糖体RNA)去除试剂盒(含纯化磁珠)|Filamentous fungus rRNA Removal Kit
产品说明书
FAQ
COA
已发表文献
Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Filamentous fungus) with purification beads是利用链霉亲和素标记的磁珠去除丝状真菌来源总RNA中的核糖体RNA以保留信使RNA（mRNA）和其他非编码RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA均具有良好的rRNA去除效果。经rRNA去除所获得的RNA样本可用于高通量测序分析的mRNA和非编码RNA，可显著提高测序结果中有效数据比例，也可用于cDNA合成及其它下游应用。
适用范围
适用于丝状真菌来源的10 ng~1 μg 总RNA样品。
产品组分
|
组分编号和名称 |
12281ES04 |
12281ES24 |
12281ES96 |
||
|
BOX I |
12281-A |
PM, Probe Mix |
13.5 μL |
80 μL |
317 μL |
|
BOX II |
12281-B |
HB, Hybridization buffer |
25 μL |
150 μL |
600 μL |
|
12281-C |
DB, Depletion buffer |
800 μL |
4.6 mL |
18.5 mL |
|
|
12281-D |
SMB, Streptavidin-coated magnetic beads |
176 μL |
1056 μL |
4.23 mL |
|
|
12281-E |
PB, Purification beads |
795 μL |
4.75 mL |
19 mL |
|
储存条件
试剂盒BOXI（Probe Mix）-25~-15℃保存，BOXII2~8℃保存，有效期1年。
注意事项
1. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
2. RNA样品应不含基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。
3. 使用前，磁珠需提前平衡至室温。
4. RNA投入量为10 ng- 1000 ng。
5. 在操作过程种，避免EP管或PCR管管盖开封（孵育过程中）或长时间处于室温状态。
6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
7.本产品仅用作科研用途！
自备材料
1. qRT-PCR质检rRNA去除效率：Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)（Cat#11201）或其他等效产品；
2. 其他材料： 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
操作步骤
1. 探针杂交
1.1 将探针、Streptavidin-coated magnetic beads和杂交Buffer从-20°C 取出，解冻后颠倒混匀，探针置于冰上放置，其余试剂平衡至室温备用。
1.2 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease free H2O稀释至12 μL。
1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。
表 1 探针杂交反应体系
|
名称 |
体积（μL） |
|
Hybridization Buffer |
5 |
|
Probe Mix |
3 |
|
Total RNA |
12（10 ng~1 μg） |
|
Total |
20 |
1.4 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中，按照表2所示反应程序，进行探针杂交反应。
表 2 探针杂交反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖105°C |
On |
|
68℃ |
10 min |
|
68℃-37℃ |
0.1℃/s |
|
37℃* |
2 min |
*注：采用梯度退火之后，需要尽快进入下一操作步骤，严禁PCR程序中出现4℃ hold，否则会影响去除效果。
2. 链酶亲和素磁珠准备
2.1低速涡旋振荡链酶亲和素磁珠使磁珠重悬。
2.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
2.3 吸取40 μL Streptavidin-coated magnetic beads于新的PCR管中，将PCR管置于磁力架上，静置2 min；。
2.4待溶液澄清后，去掉所有上清液。
2.5向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后，用移液器吹打10次混匀。
2.6将PCR管置于磁力架上，静置2 min，待溶液澄清后，去上清。
2.7向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后，用移液器吹打10次混匀。
3. rRNA去除
3.1瞬离将步骤1中杂交样品离心至管底。
3.2 将步骤2中的链酶亲和素磁珠加入步骤1的样品中，用移液器吹打10次混匀后，置于PCR仪中，按照表3所示反应程序，进行探针捕获。
表3 rRNA去除反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖105°C |
On |
|
37℃ |
15 min |
|
50℃ |
5 min |
|
*立即进入下一步骤 |
|
*注：去除反应程序完成后，需要尽快进入下一操作步骤，严禁PCR程序中出现4℃ hold，否则会影响去除效果。
3.3 瞬离将反应液离心至管底。
3.4 将样品管置于磁力架上，静置2 min。
3.5 待溶液澄清后，小心转移上清至新的PCR管中。
3.6 将PCR管置于磁力架上，静置2 min，待溶液澄清后，小心转移上清至新的PCR管中（建议）。
4. RNA纯化
4.1 准备工作：将Purification beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。用Nuclease free H2O配制 80%乙醇。
4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
4.3 吸取 180 μL Purification beads至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。
4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
4.5 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。
4.6 重复步骤 4.5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。
4.7 保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠（5~10 min）。
4.8 RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H2O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H2O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。
4.9 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取 10 μL上清（可根据步骤4.8选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease free PCR 管中。
【注】洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80℃存放。
Ver.CN20230316
Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Filamentous fungus) with purification beads是利用链霉亲和素标记的磁珠去除丝状真菌来源总RNA中的核糖体RNA以保留信使RNA（mRNA）和其他非编码RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA均具有良好的rRNA去除效果。经rRNA去除所获得的RNA样本可用于高通量测序分析的mRNA和非编码RNA，可显著提高测序结果中有效数据比例，也可用于cDNA合成及其它下游应用。
适用范围
适用于丝状真菌来源的10 ng~1 μg 总RNA样品。
产品组分
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组分编号和名称 |
12281ES04 |
12281ES24 |
12281ES96 |
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BOX I |
12281-A |
PM, Probe Mix |
13.5 μL |
80 μL |
317 μL |
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BOX II |
12281-B |
HB, Hybridization buffer |
25 μL |
150 μL |
600 μL |
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12281-C |
DB, Depletion buffer |
800 μL |
4.6 mL |
18.5 mL |
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12281-D |
SMB, Streptavidin-coated magnetic beads |
176 μL |
1056 μL |
4.23 mL |
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12281-E |
PB, Purification beads |
795 μL |
4.75 mL |
19 mL |
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储存条件
试剂盒BOXI（Probe Mix）-25~-15℃保存，BOXII2~8℃保存，有效期1年。
注意事项
1. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
2. RNA样品应不含基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。
3. 使用前，磁珠需提前平衡至室温。
4. RNA投入量为10 ng- 1000 ng。
5. 在操作过程种，避免EP管或PCR管管盖开封（孵育过程中）或长时间处于室温状态。
6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
7.本产品仅用作科研用途！
自备材料
1. qRT-PCR质检rRNA去除效率：Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)（Cat#11201）或其他等效产品；
2. 其他材料： 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
操作步骤
1. 探针杂交
1.1 将探针、Streptavidin-coated magnetic beads和杂交Buffer从-20°C 取出，解冻后颠倒混匀，探针置于冰上放置，其余试剂平衡至室温备用。
1.2 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease free H2O稀释至12 μL。
1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。
表 1 探针杂交反应体系
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名称 |
体积（μL） |
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Hybridization Buffer |
5 |
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Probe Mix |
3 |
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Total RNA |
12（10 ng~1 μg） |
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Total |
20 |
1.4 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中，按照表2所示反应程序，进行探针杂交反应。
表 2 探针杂交反应程序
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温度 |
时间 |
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热盖105°C |
On |
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68℃ |
10 min |
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68℃-37℃ |
0.1℃/s |
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37℃* |
2 min |
*注：采用梯度退火之后，需要尽快进入下一操作步骤，严禁PCR程序中出现4℃ hold，否则会影响去除效果。
2. 链酶亲和素磁珠准备
2.1低速涡旋振荡链酶亲和素磁珠使磁珠重悬。
2.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
2.3 吸取40 μL Streptavidin-coated magnetic beads于新的PCR管中，将PCR管置于磁力架上，静置2 min；。
2.4待溶液澄清后，去掉所有上清液。
2.5向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后，用移液器吹打10次混匀。
2.6将PCR管置于磁力架上，静置2 min，待溶液澄清后，去上清。
2.7向PCR管中加入80 μL Depletion buffer后，用移液器吹打10次混匀。
3. rRNA去除
3.1瞬离将步骤1中杂交样品离心至管底。
3.2 将步骤2中的链酶亲和素磁珠加入步骤1的样品中，用移液器吹打10次混匀后，置于PCR仪中，按照表3所示反应程序，进行探针捕获。
表3 rRNA去除反应程序
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温度 |
时间 |
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热盖105°C |
On |
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37℃ |
15 min |
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50℃ |
5 min |
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*立即进入下一步骤 |
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*注：去除反应程序完成后，需要尽快进入下一操作步骤，严禁PCR程序中出现4℃ hold，否则会影响去除效果。
3.3 瞬离将反应液离心至管底。
3.4 将样品管置于磁力架上，静置2 min。
3.5 待溶液澄清后，小心转移上清至新的PCR管中。
3.6 将PCR管置于磁力架上，静置2 min，待溶液澄清后，小心转移上清至新的PCR管中（建议）。
4. RNA纯化
4.1 准备工作：将Purification beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。用Nuclease free H2O配制 80%乙醇。
4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
4.3 吸取 180 μL Purification beads至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。
4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
4.5 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。
4.6 重复步骤 4.5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。
4.7 保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠（5~10 min）。
4.8 RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H2O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H2O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。
4.9 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取 10 μL上清（可根据步骤4.8选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease free PCR 管中。
【注】洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80℃存放。
Ver.CN20230316
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