附录2 常见问题与解答

HB230227

Q：购买了该产品，还需要额外再购买相应填料吗？

A：不需要了，本品含有填料。

Q：为什么柱子反压过高？

A：可能是填料被堵塞；裂解液中含有微笑的固体颗粒，建议上柱前使用 0.22 µm/0.45µm 滤膜过滤。

Q：为什么洗脱组分中没有目的蛋白？

A：可能是抗体被降解；建议适当的提高洗脱pH。

Q：为什么样品纯化过程中曲线不稳？

A：可能是样品或 buffer 中有气泡；建议样品和buffer 进行脱气。

产品描述

天然蛋白A（Protein A）是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，与分离自G型或C型链球菌属的蛋白G类似，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，可用于多种抗体（单抗和多抗）的分离纯化。在与不用的免疫球蛋白亚类的结合特性上，ProteinA 和Protein G结合性能不太一样（详见附录1）。

本品使用的是基因改造后的蛋白A，不仅维持其本身的Ig亲和特性，同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合，rProtein A Agarose Resin 4FF以高度交联的琼脂糖凝胶为基质，重组Protein A为配基，具有很高的物理化学稳定性，可以在相对较高的流速下进行抗体的纯化，适用于工业客户。利用本品经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体，使用方便，应用广泛。

本品rProtein A 4FF Chromatography Column，1 mL是一种装填了rProtein A Agarose Resin 4FF的中压预装柱，规格1 mL，预装柱具有标准接口，可以适配商品化的各类中压色谱系统，如ÄKTA 等，方便客户操作。

产品性质

运输与保存方法

冰袋运输。2~8℃保存，有效期2年。

需准备试剂

【注】建议以下缓冲液在使用前用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。

结合/洗杂缓冲液：0.15 M NaCl, 20 mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

使用方法

【注】上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。

1样品纯化（以Akta系统为例）

1）准备：将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。

2）清洗：3-5倍柱体积去离子水冲洗层析柱中储存液。

3）平衡：用5倍柱体积的结合Buffer平衡层析柱，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

4）上样：将样品加到平衡好的层析柱中，推荐流速1 mL /min，保证目的蛋白与树脂充分接触，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待检测。

【注】样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。

5）洗杂：用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，直到紫外吸收达到一个稳定的基线，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

6）洗脱：用洗脱Buffer 采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液足够将目的蛋白洗脱下来。也可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。

7）清洗及保存：依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。

2 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

3 树脂清洗

随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量下降，影响柱子的性能，这时需对柱子进行清洗：

1）去除沉淀或变性物质

① 用2倍柱体积的6 M 盐酸胍溶液进行清洗；

② 用5倍柱体积的PBS，pH 7.4 清洗。

2）去除由于疏水性吸附造成的非特异吸附物质

① 用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton™ X-100清洗；

② 用5倍柱体积的PBS, pH 7.4 清洗。

注意事项

1）请勿冷冻保存本产品。

2）所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4）本产品仅作科研用途！

附录1. 蛋白A，G对不同物种Ig的结合能力总表