Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR Probe Kit是以RNA为模板进行定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异性引物，利用耐热Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，并搭配使用探针和UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase，配合优化的缓冲体系能够特异灵敏的对RNA模板进行精确定量。

本试剂盒以预混的Mix形式提供，2×Hifair® Ⅲ P buffer包含优化的缓冲体系和dNTPs等，优化了有效抑制非特异性 PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适用于荧光标记探针的高特异性检测系统。此外，Hifair® UH Ⅲ Enzymes包含比例优化的Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase、RNase inhibitor及UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase等。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		11145ES50 (50 T)	11145ES70 (200 T)
11145-A	2×Hifair® Ⅲ P buffer	500 μL	2×1 mL
11145-B	Hifair® UH Ⅲ Enzymes	50 μL	200 μL
11145-C	Hieff® 50×High Rox	20 μL	80 μL
11145-D	Hieff® 50×Low Rox	20 μL	80 μL
11145-E	RNase free ddH2O	500 μL	2×1 mL

【注】P buffer 为Probe buffer 的简写，UH 为UNICON-Hifair 的简写。

 

适用机型

High Rox 适用机型：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™

Low Rox 适用机型：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

不需要 Rox 校正的仪器型号：

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96

Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR

 

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃避光保存，有效期1年。本品避免反复冻融。建议分装保存。

 

注意事项

1. 实验过程中请使用 RNase free 耗材。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

反应体系（以 20 μL为例）

组分	加入量	终浓度
2×Hifair® Ⅲ P buffer	10 μL	1×
Hifair® UH Ⅲ Enzymes	1 μL	–
Hieff® 50×High Rox or Low Rox	0.4 μL	–
Gene Specific Primer Forward (10 µM)	0.4 μL	0.2 μM
Gene Specific Primer Reverse (10 µM)	0.4 μL	0.2 μM
TaqMan Probe (10 µM)	0.2 μL	0.1 μM
模板 RNA	Total RNA: 1 pg-1 µg	–
RNase free ddH2O	to 20 μL	–

【注】:

a 所有试剂使用前应充分混匀。

b 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】。

c 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

d 探针浓度：探针终浓度可在50 nM-250 nM之间调整。

e 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

f 模板稀释：一步法RT-qPCR灵敏度极高，推荐将模板稀释后(如稀释至2-5 μL/样本)加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。

g 反应体系：建议以大体系进行实验，如20 μL或50 μL。

 

标准扩增程序

	反应阶段	温度	时间	循环数
1	逆转录	50℃a	15 minb	1
2	预变性	95℃	30 sec	1
3	扩增反应	95℃	10 sec	45 cycles
		60℃	30 secc

【注】:

a 对于含复杂二级结构或高GC含量的RNA模板，可将逆转录温度提高到55℃，有助于提升扩增效率和灵敏度。

b 逆转录时间可以根据模板的复杂程度进行调整，时间为5min时可满足大多数基因的鉴定。

c 不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。

HB220304

Q：标准曲线扩增效率小于 90%或者大于 110%，线性关系不好，这样的问题如何解决？

A：加样误差。加大模板稀释倍数，提高加样体积，使不同稀释度的加样体积更准确；

标准品降解。重新制备标准品；

模板浓度太高。存在反应抑制，增加模板稀释倍数； 引物扩增特异性不好。重新设计引物。

Q：反应结束无扩增曲线出现

A：反应循环数不够，可适当增加循环次数。一般设置为 40，需注意过多的循环会增加背景信号，降低数据可信度；

确认程序中是否设置了信号采集步骤。三步法扩增程序应该将信号采集设置在 72℃延伸阶段， 两步法一般在退火延伸阶段收集；

确认引物是否降解。长时间未使用的引物应先通过PAGE 电泳检测完整性； 模板浓度太低。减少稀释度重复实验；

模板降解。重新制备模板。

Q：实验重复性差如何解决？

A：加样体积不准。定期校正移液器，将模板高倍稀释，以大体积加入反应体系中； 定量PCR 仪器不同位置温度控制不一致，定期校准仪器；

模板浓度太低。模板浓度越低，重复性越差； 做 4-6 个复孔，删除其中重复性不好的孔。

Q：模板的稀释液如何选择？

A：Nuclease-Free water、DEPC 水或实验室自备的 ddH2O 都可以。不推荐使用 TE 作为稀释液，TE 里有EDTA 会抑制酶的活性。

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