第三代逆转录酶缓冲液|5×Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase Buffer
产品说明书
FAQ
COA
已发表文献
5×Hifair® Ⅲ Buffer 可与Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (Cat#14601)配套使用，为逆转录创造最佳条件。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
||
|
15662ES03 |
15662ES08 |
15662ES50 |
||
|
15662-A |
5×Hifair® Ⅲ Buffer |
1 mL |
5 mL |
50 mL |
产品应用
全长cDNA文库构建；终点法PCR；实时定量PCR等。
运输与保存方法
冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。
注意事项
1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染。
2）所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解。
3）为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5）本产品仅作科研用途！
第一链cDNA合成操作步骤
1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。）
|
组分 |
使用量 |
|
RNase–free H2O |
to 13 μL |
|
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM) |
1 μL |
|
or 1 μL |
|
|
or 1 μL |
|
|
模板RNA |
Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:10 pg-500 ng |
65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）
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组分 |
使用量 |
|
上一步的反应液 |
13 μL |
|
5×Hifair® Ⅲ Buffer |
4 μL |
|
dNTP Mix (10 mM) |
1 μL |
|
Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (800 U/μL) (Cat#14601) |
200 U |
|
RNase inhibitor (40 U/µL) |
1 μL |
3. 逆转录程序设置
|
温度 |
时间 |
|
25℃ |
5 min |
|
55℃ |
15–30 min |
|
85℃ |
5 min |
【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略；
2）逆转录温度：推荐使用55℃；对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃；
3) 可将逆转录时间延长到45-60min，有助于提高产量；
4）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
HB220615
5×Hifair® Ⅲ Buffer 可与Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (Cat#14601)配套使用，为逆转录创造最佳条件。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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15662ES03 |
15662ES08 |
15662ES50 |
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15662-A |
5×Hifair® Ⅲ Buffer |
1 mL |
5 mL |
50 mL |
产品应用
全长cDNA文库构建；终点法PCR；实时定量PCR等。
运输与保存方法
冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。
注意事项
1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染。
2）所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解。
3）为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5）本产品仅作科研用途！
第一链cDNA合成操作步骤
1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。）
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组分 |
使用量 |
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RNase–free H2O |
to 13 μL |
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Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM) |
1 μL |
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or 1 μL |
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or 1 μL |
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模板RNA |
Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:10 pg-500 ng |
65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）
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组分 |
使用量 |
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上一步的反应液 |
13 μL |
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5×Hifair® Ⅲ Buffer |
4 μL |
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dNTP Mix (10 mM) |
1 μL |
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Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (800 U/μL) (Cat#14601) |
200 U |
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RNase inhibitor (40 U/µL) |
1 μL |
3. 逆转录程序设置
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温度 |
时间 |
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25℃ |
5 min |
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55℃ |
15–30 min |
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85℃ |
5 min |
【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略；
2）逆转录温度：推荐使用55℃；对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃；
3) 可将逆转录时间延长到45-60min，有助于提高产量；
4）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
HB220615
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