His-tag蛋白纯化磁珠是一种高容量的新型磁性微球产品，用于快速、高效的纯化 His标签融合蛋白。磁珠在磁场作用下直接从生物样品中可一步纯化出高达95%纯度的目的蛋白，极大的简化了纯化工艺和提高纯化效率。将含有His标签蛋白的细胞裂解物添加到MagBeads 中，让蛋白质与其充分结合，然后可从磁珠中洗脱分离出目的蛋白。

与传统柱层析方法相比，使用磁珠纯化His标签蛋白无需控制上样流速和多次离心样品，也不需要昂贵的层析和离心设备。样品与磁珠的结合以及目的蛋白与磁珠的分离简单、快捷，而且更容易实现高通量、自动化的蛋白纯化方法。适合科研和工业客户高通量地进行组氨酸标签蛋白的纯化。

该磁珠以4%琼脂糖凝胶为基质通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸(NTA)，螯合镍离子(Ni²⁺)后，可以形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构很有效的保护了镍离子免受小分子的进攻更加稳定。

His标签蛋白纯化磁珠广泛适用于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的可溶性组氨酸标签蛋白，也可用于变性蛋白的纯化（包涵体需变性后再进行纯化）。

 

产品性质

基质	磁性琼脂糖微球
载量	> 40 mg 6×His-tagged protein/mL磁珠
粒径	30-100 μm
磁珠浓度	磁珠悬浮于保护液中，含量为20%（V/V)
储存缓冲液	含20%乙醇的1×PBS

 

运输和保存方法

冰袋运输。4℃长期储存，有效期2年。

 

注意事项

1.磁珠保存过程中避免冷冻、干燥和高速离心等操作。

2.磁珠使用前，请充分震荡，使磁珠保持均匀的悬浮状态。

3.使用过的磁珠重复使用时，建议纯化同一种蛋白，纯化不同种蛋白时，建议使用新磁珠，以避免交叉污染。

4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5.本产品仅作科研用途！

 

使用方法

一、缓冲液配制

1.缓冲液使用基本原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。

2.Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

3.可溶性蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表1，包涵体蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2和表3。

 

二、样本制备

2.1细菌或酵母表达的蛋白

1）将培养液转移到离心杯中，7,000 rpm (7,500 xg)，离心15 min收集菌体，然后按照菌体：Lysis Buffer=1: 10 （W/V）加入Lysis Buffer，加入终浓度为1 mM的PMSF。同时可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与磁珠的结合。

2）加入溶菌酶,使其工作浓度为0.2-0.4 mg/mL。如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶。

3）将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10 μg/mL RNase A和5 μg/mL DNase I）,混匀，冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

4）将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000 rpm (15,000 xg)，4℃离心20-30 min。 取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2.2酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1）将细胞培养液转移至离心杯中，5,000 rpm (3,800 xg)，离心10 min，收集菌体得上清，如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可直接使用；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需用Lysis Buffer透析才能上样。

2）对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，然后用Lysis Buffer透析后才能上样。

2.3包涵体蛋白纯化（变性条件）

1）将培养液转移到离心杯中，7,000 rpm (7,500 xg)，离心15 min收集菌体，去掉上清。

2）按照菌体：Lysis buffer（不含8M尿素）=1:10 (W/V)将菌体悬浮起来，混匀，冰浴超声破碎。

3）将破碎液转移至离心管中，10,000 rpm (15,000 xg)，4℃离心20-30 min。去掉上清，步骤2和3可以重复一次。

4）按照菌体：Lysis buffer（含8M尿素）=1:10 (w/v)的比例将包涵体充分悬浮。

 

三、磁珠预处理

3.1 准备

将磁珠充分混匀，使用移液器取适量的磁珠悬浮液，置于离心管中，将离心管置于磁力架上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清。

3.2平衡

将离心管从磁力架上取下来，加入与悬浮液等体积的Lysis Buffer，使用枪头反复吹打5-10次，将离心管置于磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液，重复洗涤2次。

 

四、磁珠与目的蛋白结合

4.1 结合

将含有目的蛋白的上清液加入到处理好的磁珠中，颠倒混匀。将离心管置于混合仪上，室温旋转孵育30 min （如果目标蛋白不稳定，建议2-8℃下孵育1 h）。

4.2 洗杂

将离心管置于磁分离器，待溶液变澄清后，用移液器移出上清液，保留上清液，以备取样检测。向离心管中加入2倍悬浮液体积的Wash Buffer，使用枪头反复吹打5-10次，将离心管置于磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸取上清液，保留，以备取样检测。重复上述步骤2次。

4.3 洗脱

建议将3-5倍磁珠体积的Elution Buffer加入到离心管中，使用移液器轻轻吹打3-5次，混匀，将离心管置于磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸取上清液，即为目的蛋白。如有需要，可以重复上述步骤1次，以提高目的蛋白的回收量。用户也可根据实验结果调整缓冲液中的咪唑浓度。

 

五、磁珠保存

1. 向装有磁珠的离心管中加入1 mL Elution Buffer，用移液器反复吹打3-5次，使磁珠充分悬浮，然后置于磁分离器，吸弃上清，重复该操作2次。

2. 向离心管中加入1 mL去离子水，用移液器反复吹打3-5次，使磁珠充分悬浮，然后置于磁分离器，吸弃上清，重复该操作2次。

3. 向离心管中加入含20%乙醇的1×PBS，使总体积为磁珠初始悬浮液体积，保存于2-8 ℃。

 

六、SDS-PAGE 检测

将纯化得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分）使用SDS-PAGE检测纯化效果。

 

表1. 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer	50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         0.68 g
Wash Buffer	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         1.36 g
Elution Buffer	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         17.0 g

以上缓冲液适用于多数His标签蛋白的纯化，客户也可根据实验结果调整缓冲液中的咪唑浓度。

 

表2. 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方,pH洗脱方式

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·H2O     13.80 g Tris·Cl            12.10 g
Wash Buffer	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至6.3，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·H2O     13.80 g Tris·Cl            12.10 g
Elution Buffer	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至4.5，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·H2O     13.80 g Tris·Cl            12.10 g

 

 

表3. 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方,咪唑洗脱方式

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer	8 M Urea 50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         0.68 g
Wash Buffer	8 M Urea 50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea             480.50 g NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         1.36 g

 

Elution Buffer

8 M Urea 50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌

Urea             480.50 g NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g NaCl             17.54 g Imidazole         17.0 g

 

表4. Ni NTA Magarose Beads试剂耐受情况

试剂种类	浓度
还原剂	5 mM DTE 1 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione
变性剂	8 M urea 6 M Gua-HCl
去污剂	2% TritonTM X-100, nonionic 2% TweenTM20, nonionic 2% NP-40, nonionic 2% Cholate, anionic 1% CHAPS, zwitterionic
其他类	500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate

 

HB220315

 

Q：目标蛋白回收率低怎么办？

A：1)延长粗蛋白与磁珠的孵育时间；​

  2)适当降低样品溶液和Binding/Wash Buffer中的Imidazole浓度；

  3)添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；

  4)增加磁珠用量；

  5)延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数；

  6)在样品溶液和其它缓冲液中添加表面活性剂等物质。

Q：如何提高目标蛋白纯度？

A：1)适当提高样品溶液和Binding/Wash Buffer中的Imidazole和NaCl浓度；

  2)在纯化过程中添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；

  3)在样品溶液和缓冲液中加入表面活性剂等物质；

  4)延长清洗的时间，增加清洗次数；

  5)采用梯度Imidazole浓度洗脱目标蛋白。

Q：是否有测试结果？

A:有，见下图

[1] Xu G, Han S, Huo C, et al. Signaling specificity in the c-di-GMP-dependent network regulating antibiotic synthesis in Lysobacter. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9276-9288. doi:10.1093/nar/gky803(IF:11.561)