BIOCHECK Inc.是新抗体发现和免疫测定开发服务的综合提供商。
PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT Catalog Number: BC-1301
pd-1酶免疫测定试剂盒 目录编号：bc-1301
酶免疫法定量测定人血清和血浆中Pd-1浓度
只作研究用途
不适用于诊断程序
介绍
程序性细胞死亡蛋白1(pd-1，CD 279，pdd 1)是一种细胞表面受体，是调节T细胞炎症活动和维持免疫外周耐受的关键。 系统(1)。pd-1可以与配体pd-l1和pd-l2t相互作用。pd-1具有胞外IGV结构域、跨膜结构域和胞内尾部两个磷酸化位点(shp-1和shp-2)。 o下调免疫系统，抑制T细胞活性(2)。抗原识别后，活化的T细胞在其表面表达pd-1，产生干扰素，诱导pd的表达。 -L1，从而促进细胞凋亡或细胞死亡。(3)当被肿瘤细胞劫持时，pd-1配体的异常表达抑制免疫调节的T细胞活化，导致疾病进展。 （表示方向）向 (4).
血清和血浆中Pd-1水平升高与类风湿关节炎和皮肤硬化有关(5，6)。Pd-1主要由肿瘤浸润的T细胞(7)表达.进一步区域 研究表明，使用针对pd-1免疫检查点的单克隆抗体有助于在理解和治疗黑色素瘤和其他vario等癌症方面取得突破性进展。 美国非小细胞肺癌(4)。
测定原理
pd-1酶联免疫吸附试验是以固相酶联免疫吸附试验为基础的.该检测系统使用了针对不同抗原决定的*的单克隆抗体对。 pd-1分子上的NT。用一种小鼠抗PD-1单克隆抗体进行固相固定(在微滴度井上).另一种与辣根碱结合的单克隆抗pd-1抗体 过氧化物酶(HRP)存在于酶的共轭溶液中。测试样本被允许与这两种抗体依次反应，导致pd-1分子被夹在固体ph之间。 ASE和酶解抗体。在室温下进行两次单独的60分钟孵育后，用洗涤缓冲液冲洗水井，除去未结合的标记抗体。添加了TMB试剂 D在黑暗条件下孵育20分钟，形成蓝色。随着停止解决方案的添加，颜色开发停止，将颜色更改为黄色。c Pd-1的浓度与样品的颜色强度成正比.在450 nm处分光度法测定吸光度。
提供的试剂和材料
抗体包被井(1板，96井)微滴度井，用小鼠单克隆抗pd-1包被。
含防腐剂的磷酸盐缓冲液-BSA溶液中50 ng/ml Pd-1标准品(0.5 mL/小瓶)
标准稀释剂和样品稀释剂(30 mL/瓶，1瓶)含有含防腐剂的磷酸盐缓冲液-bsa溶液。
酶结合试剂(12 mL/小瓶，1小瓶)含有与辣根过氧化物酶结合的小鼠单克隆抗pd-1。
20倍洗涤剂磷酸盐缓冲液(50 mL/瓶，1瓶)
TMB试剂(11 mL/瓶，1瓶)含有一步TMB溶液。
停液(11 mL/瓶，1瓶)含有稀释盐酸(1NHCl)
贮藏条件
将未打开的工具包保存在2-8°C，收到后，当它没有使用，直到到期显示在工具包标签上。有关过期日期，请参阅包标签。
将微滴度板放在一个装有干燥剂的密封袋中，以尽量减少对潮湿空气的暴露。
试剂准备
1.所有试剂在使用前应允许达到室温(18-25°C)。
2.对于每次测试运行，准备一个新的标准集。
3.用标准/样品稀释剂稀释50~10 ng/mL。用标准/样品稀释剂制备10 ng/mL标准的双倍系列稀释剂：
a.10纳克/毫升：0.12毫升50纳克/毫升0.48毫升标准品/样品稀释剂
b.5纳克/毫升：0.25毫升10纳克/毫升标准品/样品稀释剂
c.2.5纳克/毫升：0.25毫升5纳克/毫升标准品/样品稀释剂
1.25ng/mL：0.25毫升2.5纳克/毫升标准品/样品稀释剂
e.0.625 ng/mL：1.25ng/mL标准品/样品稀释剂0.25mL
f.0.313 ng/mL：0.25mL/0.625 ng/mL标准品/样品稀释剂2
标准稀释剂0.156 ng/mL：0.313 ng/mL 0.25mL
i.0 ng/mL：0.25 mL标准稀释剂
5.病人样本在使用前需要稀释4倍。制备一系列小管(即1.5 mL微离心管)，将60L血清与180 L标准/样品稀释剂混合。
6.工作洗涤缓冲器：从20倍库存中制备1倍洗涤缓冲液。加入50毫升的20倍洗涤缓冲液库存到950毫升的直接水。工作洗涤缓冲液在2~8°C温度下稳定运行30天.注：任何晶体 这可能是由于高盐浓度的存在，必须在室温下再溶解，然后再进行稀释。
检测程序
准备标准。见试剂准备。
稀释样品1：4稀释。见试剂准备。
确保所需数量的涂层井在保持架。
配发Pd-1标准的100mL，并将样品稀释到适当的井中.
室温(18-25°C)孵育60 min.
将培养皿中的内容物倒入废容器中，将孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗缓冲液冲洗微滴水井5次。把水井打到吸水纸或纸上 r毛巾去除所有残留水滴。
将Pd-1工作酶结合剂的100mL配伍到每口井中.
室温(18-25°C)孵育60 min.
将培养皿中的内容物倒入废容器中，将孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗缓冲液冲洗微滴水井5次。把水井打到吸水纸或纸上 r毛巾去除所有残留水滴。
在每口井中分配100mL TMB溶液。
室温(18-25°C)孵育20分钟.
通过在每口井中加入100mL的停止溶液来停止反应。
轻轻搅拌30秒。重要的是要确保所有的蓝色*变成黄色。
14.在450 nm处读取吸光度，15分钟内使用微滴度良好的阅读器。
统计
计算每组参考标准、对照和样品的平均吸光度值(OD 450)。
通过绘制每个参考标准的平均吸光度(以纳克/毫升为单位)绘制在图表纸上，并在垂直(Y)轴和浓度上绘制一条标准曲线。 在水平(X)轴上。
用每个样品的平均吸光度值，从标准曲线上测定相应的Pd-1浓度(ng/mL)。视经验和/或计算机可用情况而定 可以使用其他的数据缩减方法。
样品的检出值应乘以稀释倍数为4，得到Pd-1的结果为ng/ml。
标准曲线实例
一个典型的标准运行结果，吸光度读数在450 nm处显示在Y轴上，而pd-1浓度显示在X轴上。注：这条标准曲线是为了说明 仅用于计算未知数，不应用于计算未知数。每个实验室必须在每个实验中生成自己的数据和标准曲线。
工作特性
敏感，感受性
用2SD法测定的Pd-1酶联免疫吸附试验的低检出浓度为0.15ng/ml。
度，准确（性）
- 在一次测定中，通过对三种不同样品的重复测定，确定了内测精密度.批内可变性如下所示：
b.在一系列单独校准的测试中，通过对三个不同样本的重复测量，确定了运行间精密度。批间变异显示b。 below在下面，到下面
1.回收率和线性研究。回收样品加入已知的Pd-1水平，并一式两份进行测定。平均回收率为105.3%。
b. 对三个样品进行连续稀释，以确定线性度。平均回收率为99.6%。
参考
费夫，B.T.，&Pauken，K.E.(2011年)。PD-1通路在自身免疫和外周耐受中的作用。“纽约科学院年鉴”，1217(1)，45-59。
Riella，L.V.，Paterson，A.M.，Sharpe，A.H.，&Chandraker，A.(2012)。PD-1通路在免疫应答中的作用。美国移植杂志：美国社会杂志 移植和美国移植外科医生协会，12(10)，2575-2587。
Zak，Krzysztof&Kitel，Radosław&Przetocka，Sara&Golik，Przemysław&Guzik，Katarzyna&Musielak，Bogdan&D mling，Alexander&Dubin，Grzegorz&Holak，Tad。(2015年)。胡氏情结结构 人类编程死亡1，pd-1，及其配体PD-L1。结构。23.。10.1016/j.str.2015.09.010。
Zoran Gatalica，卡丽·斯奈德，托德·马尼，阿纳托尔·加扎尔普尔，丹尼尔·霍特曼，年青肖，佩吉·奥夫伯格，因加罗斯，加吉·巴苏，塞米尔·弗拉尼茨，亨利·林奇，丹尼尔·冯霍夫和奥米德·哈米 d.程序化细胞死亡1(PD-1)及其配体(PD-L1)在常见癌症中的作用及其与分子肿瘤类型的关系。癌症流行病学研究2014年12月1日(23)(12)2965-2970。
Greisen，S.，Rasmussen，T.，Stengaard-Pedersen，K.，Hetland，M.，H rselv-Petersen，K.，Hvid，M.，&Deleuran，B.(2013年)。可溶性程序性死亡1(spd-1)的增加与疾病活动有关。 早期类风湿关节炎的影像学进展。斯堪的纳维亚风湿病学杂志，43(2)，101-108。
Yanaba，K.，Hayashi，M.，Yoshihara，Y.，&Nakagawa，H.(2016)。系统性硬化症患者血清可溶性程序性死亡-1和程序性死亡配体-1水平与皮肤硬化程度的关系 。皮肤科杂志，43(8)，954-957。
7.Ahmadzadeh，M.，Johnson，L.A.，Heemskerk，B.，Wunderlich，J.R.，Dudley，M.E.，White，D.E.，&Rosenberg，S.A.(2009年)。肿瘤抗原特异性CD8 T细胞浸润肿瘤高表达水平 Pd-1的LS和功能受损。血液，114(8)，1537-1544。