细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书

产品详情

 产品描述

浆核蛋白的分离提取属于生物学研究的重要实验之一，对于探究细胞中的不同组分以及蛋白在细胞中的定位具有重要的意义，促进亚细胞蛋白组学发展，提取的核蛋白可以用于后续转录调控方面研究，例如Pull Down，EMSA，footprinting等，为分子机制深入探索提供可靠技术支持。

基本原理如下：细胞在低渗条件下胞膜会发生胀破，释放浆蛋白，离心得到细胞核沉淀，最后利用高盐溶液抽提得到核蛋白，本试剂盒利用该原理，优化配方组分和提取方法提供了一种高效提取浆核蛋白的方法，较大保持蛋白的天然活性，同时浆蛋白与核蛋白之间存在极少的交叉污染，为后续研究提供可靠的样本。本试剂盒只适用于细胞样品的核浆蛋白提取，每T约适用于约一个大皿细胞量的提取。

产品组成

运输与保存

–20℃保存，一年有效

实验步骤

1.试剂准备：

室温溶解试剂盒中三种组分，溶解后混匀冰上放置备用

（1）自备100 mM PMSF母液；

（2）浆蛋白抽提工作液：用细胞浆蛋白抽提试剂A将试剂C稀释至1X用，临用前加入PMSF母液使其终浓度为1mM（现配现用）；

（3）核蛋白抽提工作液：用细胞浆蛋白抽提试剂B将试剂C稀释至1X用，临用前加入PMSF母液使其终浓度为1mM（现配现用）。

2. 收集细胞沉淀

①对于贴壁细胞：弃去原来培养基，PBS清洗一遍，用细胞刮或消化收集细胞沉淀，尽可能吸净上清，留下沉淀备用（推荐使EDTA溶液代替胰酶消化，以免胰酶残留降解目的蛋白；每个样品可用小离心机或原来离心机进行二次离心，充分弃去残留上清以保证后续提取效果不受影响）；②对于悬浮细胞：离心收集细胞，PBS清洗一遍，尽可能吸净上清，留下沉淀备用。

3. 浆蛋白的提取

（1）约50 μL体积的细胞沉淀中加入200 μL细胞浆蛋白抽提工作液，反复吹打混匀十多次至沉淀散离，冰浴10 min后再次吹打混匀十多次，继续冰浴裂解5 min。

（2）高速剧烈涡旋5s，4℃ 600g离心5 min，此时得到的沉淀为细胞核沉淀，上清为粗提的浆蛋白，将此上清再次4℃ 12000g离心10 min去除杂质即得到纯净的细胞浆蛋白。

4.核蛋白的提取

（1） 对于步骤3-(2)中获得的细胞核沉淀加入400 μL细胞浆蛋白抽提试剂A（此时使用的试剂A不含试剂C），吹打混匀十多次至沉淀分散，4℃，冰浴5 min 600 g离心5 min，弃去上清保留沉淀，得到的沉淀重复该操作一次，最后尽最大努力弃去上清保留沉淀。

（2）对于步骤4-(1)中获得的沉淀加入100 μL细胞核蛋白抽提工作液，冰浴裂解30min，期间多次涡旋振荡10-15s以充分裂解（核蛋白裂解后，如果条件允许建议使用超声以大功率的提取核蛋白，增加蛋白质的溶解度，提高实验结果一致性，超声3次，每次5秒，功率90w）。

（3）4℃ 12000g离心10 min收集上清为细胞核蛋白。抽提得到的浆核蛋白可立即使用，也可-80℃保存备用。

 

实验案例分析

细胞刮收集A549，H1299，Hela三种细胞沉淀样品，每种细胞约一个大皿的细胞量，按照试剂盒使用说明进行核浆蛋白的分离提取，得到的浆蛋白和核蛋白用于western blot分析，考察其核浆分离效果，结果如下图所示：

         

图3.三种细胞样品的浆核蛋白western blot分析结果

注意事项

（1）需自备PMSF。PMSF母液用无水乙醇配制，临用前2-3 min内加入，以免在水溶液中很快失效；

（2）所有的抽提步骤都需要在冰上或者4℃进行；

（3）本试剂盒只适用于细胞样品浆核蛋白的提取分离，提取到的蛋白样品可直接用BCA法进行蛋白浓度测定；

（4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套；

（5）本产品仅作科研用途！