G418 Sulfate(Geneticin) 遗传霉素 说明书

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基本信息

产品简介

        G418 Sulfate（G418硫酸盐），也称作Geneticin（遗传霉素），是一种结构类似于庆大霉素B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷类抗生素，通过影响80S核糖体功能和阻断延伸步骤来干扰蛋白合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、高等植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。其抗性基因（主要为neo基因）位于转座子Tn601（903）或Tn5（来源于细菌），但是可以在真核细胞中表达。通过基因重组技术将这些抗性基因导入细胞，使其获得对G418的耐药性，从而用来筛选和维持培养携带抗性基因的原核或者真核细胞。 哺乳动物细胞中，当抗性基因neo被整合进真核细胞基因组后，使其编码表达氨基糖苷磷酸转移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase，APH(3')II）。此酶通过共价修饰G418的氨基或羟基功能，抑制抗生素-核糖体间的相互作用，从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生抗性。稳转细胞株筛选实验，需要建立杀灭曲线（剂量反应曲线）确定杀死无抗性细胞的zui低有效浓度。 植物细胞中，通过转染携带nptII基因的抗性质粒孵育其抗性。nptII基因也能编码表达氨基糖苷磷酸转移酶，这个酶使得多种抗生素丧失活性，包括G418，卡那霉素和巴龙霉素。

使用说明

1. G418储存液的配制（50 mg/mL，活性浓度）

    （1）活力单位的换算

根据此公式进行换算：（1000/A₀）×A₁=A₂，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而异。可见批次对应的质检报告，或者瓶子上的标签。A₁是想配制的活性G418浓度。A₂是实际称重的粉末与体积比浓度。

比如若所用批次的G418 活力值为：750 µg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配制10 mL的G418储存液（活性浓度，50 mg/mL），则需要称取663.3 mg粉末。

（2）除菌和保存

根据上述换算得到的实际粉末称重量，加入10 mL无菌去离子水内使其wan全溶解。

先用5 mL无菌去离子水预湿润0.22 μm针头式过滤器，除尽水。之后使用此滤器过滤，除菌后分装成单次使用的小量（如1mL）放到-20℃冻存，1年稳定。

 【注】

      ①不要对混浊的溶液进行过滤，因为混浊的溶液意味着未wan全溶解，过滤过程中会造成药物损失，降低终液的活性。

      ②不建议使用液体培养基，NaCl，磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液。

 

 2. 常用筛选浓度

 一般来说，刚开始筛选转化子需要高浓度的G418，并用一个较低浓度的G418用于维持培养。生长条件，细胞类型和其他的环境因素都可能影响G418的用量，因此第一次使用的实验体系建议通过杀灭曲线（kill curve），即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。

 通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL；植物细胞：10-100 μg/mL；酵母细胞：500-1000 μg/mL。

 以下是一些细胞类型使用G418筛选使用的浓度，可做参考。

3. 杀灭曲线的建立

      【注意事项】为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素zui低浓度，可通过建立杀灭曲线来实现，至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性zui强，因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。

（1）第一天：未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，37℃，CO₂培养过夜。

     【注】对于需要更高密度来检测活力的细胞，可增加接种量。

（2）根据细胞类型，设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

（3）第二天：去除旧的培养基，换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。

（4）接下来每3-4天更换新的含药物培养基。

（5）按照固定的周期（如每2天）进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数（通常是7-10天）内能够杀死绝大多数细胞的zui低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。

 

4. 稳定转染细胞的筛选

      （1）转染48 h后，用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。

    【注】细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤成效更优。当细胞过于稠密，其效率会降低。为了得到较好的筛选效果，细胞稀释至丰度不超过25%。

（2）每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。

（3）筛选7天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染以及筛选效果。

（4）挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。

（5）之后更换正常培养基培养即可。

运输与保存方法

常温运输。-20℃避光保存，有效期3年。避免受潮，否则会降低抗生素活力。

注意事项

（1）本品不可高压灭菌；

（2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂（如青霉素/链霉素）共同使用，因为它们是G418的竞争性抑制剂。其他的抗生素也会产生交叉活性。

（3）配制G418溶液时，一定要根据G418批次不同的活力值（potency）来进行换算，从而得到需要活性浓度的储存液及工作液。

（4）G418加入培养体系中未转染的细胞有可能不会被杀死，原因在于药物浓度过低，或者细胞密度过高。另外，快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞，更容易被杀死。对照细胞（未转染）可能抗生素添加5-7天后才能杀死，转染细胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

（5）即使加入杀死剂量的G418，细胞可能会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。

（6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。