Hieff NGS^® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2是用于Illumina^®/MGI^®测序平台的DNA&RNA共建库试剂盒，包含高效cDNA合成试剂，酶切建库试剂。与传统的建库法比较，本产品可以DNA&RNA一管式建库，一步高效完成cDNA合成，同时采用高质量的片段化酶，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，肿瘤样本，复杂样本，同时能兼容FFPE 样本的建库。该试剂盒使用了最新优化的连接酶，改善了接头连接时的片段自连现象，同时替换了新型高保真酶，进一步提升了扩增的均一性和保真性。

本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

 

产品组分

组分编号和名称			12305ES08	12305ES24	12305ES96
12305-A		Random Primer	20 μL	60 μL	240 μL
12305-B		cDNA Reaction Buffer	64 μL	192 μL	768 μL
12305-C		cDNA Enzyme Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12305-D		Smearase Buffer	80 μL	240 μL	960 μL
12305-E		Smearase Enzyme Mix	40 μL	120 μL	480 μL
12305-F		Ligation Enhancer	240 μL	720 μL	2×1440 μL
12305-G		Novel T4 DNA Ligase	40 μL	120 μL	480 μL
12305-H		2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
*		Primer Mix*	40 μL	120 μL	480 μL

注：*标注表示该成分不包含在本试剂盒，需要额外配置，本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台，但需要额外配置专属于Illumina^®或者MGI^®的primer mix(Cat# 13334 Primer Mix for MGI^®以及Cat# 13335 Primer Mix for Illumina^®)

 

运输与保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

 

注意事项

一．关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

6. 本产品仅作科研用途！

二、关于接头连接 (Adapter Ligation)

1. 本公司可提供Illumina^®或者MGI^®长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

4. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1-1  Input Total DNA&RNA量与Illumina^®接头使用浓度推荐表

Input Total DNA&RNA	Illumina® Adapter stock concentration
<10 ng	3 μM
≥10 ng	15 μM

表1-2  Input Total DNA&RNA量与MGI^®接头使用浓度推荐表

Input Total DNA&RNA	MGI® Adapter stock concentration
<10 ng	5 μM
≥10 ng	10 μM

*可根据不同类型total DNA&RNA样本及投入量，按需求适当调整Adapter使用量。

三、关于文库扩增（Library Amplification）

文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得1 mg文库的推荐循环数。

表2  Input Total DNA&RNA与扩增循环数推荐表*

Input Total DNA&RNA	Number of cycles
<1 ng	10~12
1 ng	9~10
10 ng	6~7
50 ng	4~5
100~1000 ng	4

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

四、DNA磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

六、自备材料（Other Material）

1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效产品。

2.Adapter：Complete Adapter for Illumina^®使用（Cat#13519-13520或其他等效产品）或Complete Adapter for MGI^®使用（Cat#13360-13362或其他等效产品）。

3. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

4. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

建库流程图

 

使用方法

Step 1 RNA变性

1. 将 Random Primer 室温解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。按照表3配置反应液：

表3  RNA预变性反应体系

名称	体积（μL）
Random Primer	2.5
DNA&RNA（1 ng-1 ug）	32.5
Total	35

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表4所示设置反应程序，进行RNA的预变性。

表4  RNA预变性反应程序

温度	时间
热盖 75°C	On
70°C	5 min
立即置于冰上	3 min

Step 2 cDNA 的合成（cDNA Synthesis）

1. 将cDNA合成试剂从-20°C取出，室温解冻，颠倒混匀后瞬离。按表5所示，配制cDNA合成的反应液。

表5  cDNA合成反应体系

名称	体积（μL）
变性的DNA&RNA	35
cDNA Reaction Buffer	8
cDNA Enzyme Mix	2
Total	45

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表6所示设置反应程序，进行cDNA的合成。

表6  cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖 105°C	On
25°C	5 min
42°C	20 min
85°C	5 min
4°C	Hold

Step 3 cDNA片段化/末端修复/dA尾添加（cDNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

该步骤将cDNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表7中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于冰上配制表7反应体系。

表7  cDNA片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应体系

名称	体积（μL）
cDNA	45
Smearase Buffer	10
Smearase Enzyme Mix	5
Total	60

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表8所示反应程序，进行cDNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表8  cDNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序

温度	时间
热盖105°C	on
4°C	1 min*
30°C	5-15 min**
72°C	20 min
4°C	Hold

【注】：*cDNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4°C，待模块温度降至4°C时，将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表9。

表9  片段化时间选择表

插入片段主峰大小	片段化时间
150~200 bp	5~15 min

Step 4 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina^®或者MGI^®接头。

1. 参考注意事项二中的表1，根据Input DNA&RNA量，稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表10中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于Step 3步骤结束后的PCR管中继续配制表10所示反应体系。

名称	体积（μL）
dA-tailed DNA	60
Ligation Enhancer	30*
Novel T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5**
Total	100

表10  Adapter Ligation体系

【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司illumina接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1-1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。

**本公司MGI接头原始浓度为10 μM, 请根据注意事项二表1-2的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表11所示反应程序，进行接头连接反应：

表11  Adapter Ligation反应程序

温度	时间
热盖Off	–
20°C	15 min
4°C	Hold

 

Step 5连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.45×，Beads:DNA=0.45:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

Step 6文库扩增（Library Amplification）

该步骤将对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表12中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表12所示反应体系。

表12-A  illumina短接头连接产物PCR反应体系                                                                  表12-B  illumina长接头连接产物PCR反应体系

组分名称	体积 (μL)	组分名称	体积 (μL)
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	25	2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	25
Universal Primer/ i5 Primer*	2.5	Primer Mix**	5
Index Primer/ i7 Primer*	2.5
Adapter Ligated DNA	20	Adapter Ligated DNA	20
Total	50	Total	50

【注】：*如果使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂 (Cat#12414-12415)中配备的Index primer进行扩增。**如果您使用的是Indexed Adapter (Cat#13519-13520)，俗称长接头（大Y接头），可用Cat#13335中的Hieff NGS^® Primer Mix for Illumina^®进行扩增。

表12-C  MGI接头连接产物PCR反应体系

组分名称	体积（μL）
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	25
Primer Mix for MGI®*	5
Adapter Ligated DNA	20

【注】：*该primer mix for MGI不含在本试剂盒中，可用Cat#13334中的Hieff NGS^® Primer Mix for MGI^®进行扩增。
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表13示反应程序，进行PCR扩增。

表13  PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	参照注意事项三，文库扩增
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	1 min	1
4°C	Hold	–

 

Step 7 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入32 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取30 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

Step 6 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

 

HB230214