HEK293宿主细胞残留DNA片段定量分析试剂盒

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HEK293宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中不同长度的HEK293残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用qPCR荧光探针原理，专一快速检测200 bp以下及以上的HEK293 DNA残留，其定量限可以达到10 fg/μL水平，且配套有HEK293 DNA Control（DNA定量参考品）。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（Cat#18461ES/18462ES）配套使用。

组分信息

组分编号	组分名称	41316ES70	41316ES74
41316-A	HEK293 qPCR Mix	0.75 mL×4管	1.5 mL×4管
41316-B1	HEK293 Primer&Probe Mix-82	250 μL×1管	500 μL×1管
41316-B2	HEK293 Primer&Probe Mix-133	250 μL×1管	500 μL×1管
41316-B3	HEK293 Primer&Probe Mix-227	250 μL×1管	500 μL×1管
41316-B4	HEK293 Primer&Probe Mix-515	250 μL×1管	500 μL×1管
41316-C	DNA Dilution Buffer	1.8 mL×2管	1.8 mL×4管
41316-D	HEK293 DNA Control（30 ng/μL）	25 μL×1管	50 μL×1管

储存条件

1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。其中A组分和B1、B2、B3、B4组分均需避光保存。

2. 收到货后，请检查共7个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

使用说明

1. HEK293 DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

HEK293片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段，分别为：82 bp、133 bp、227 bp、515 bp。在建立标曲时，需分别对不同的扩增片段设置标曲，并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer（DNA稀释液）将HEK293 DNA Control定量参考品进行梯度稀释^*，稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下：

1）将试剂盒中HEK293 DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2）取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3）在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL HEK293 DNA Control，即稀释为3 ng/μL，振荡混匀后低速离心10 sec，该浓度可分装置于–20℃短期保存（不超过3个月）^**，使用时避免反复冻融。

4）在Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer^***，再进行梯度稀释^****，具体稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

表1 标准品梯度稀释

^*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试300 pg/μL-30 fg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

^**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

^***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。

^****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 待测样本TS的制备

根据实验设置待测样本TS，具体操作如下：

1）取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为TS，进行样本前处理，制备待测样本TS纯化液。

2）为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求，前处理后的待测样品量需≥120 μL，因此建议每个样品同时准备2管进行前处理，提取完成后混匀使用。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1）取100 μL样本基质溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2）阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

3）为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求，前处理后的NCS样品量需≥120 μL，因此建议每个样品同时准备2管进行前处理，提取完成后混匀使用。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1）无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2）每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液（即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL对应HEK293 Primer&Probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

5. 反应体系

82 bp反应体系	体积(μL)
HEK293 qPCR Mix^*	15
HEK293 Primer&Probe Mix-82	5
DNA Template^**	10
总体积^***	30

表2 82 bp扩增片段的反应体系

133 bp反应体系	体积(μL)
HEK293 qPCR Mix^*	15
HEK293 Primer&Probe Mix-133	5
DNA Template^**	10
总体积^***	30

表3 133 bp扩增片段的反应体系

227 bp反应体系	体积(μL)
HEK293 qPCR Mix^*	15
HEK293 Primer&Probe Mix-227	5
DNA Template^**	10
总体积^***	30

表4 227 bp扩增片段的反应体系

515 bp反应体系	体积(μL)
HEK293 qPCR Mix^*	15
HEK293 Primer&Probe Mix-515	5
DNA Template^**	10
总体积^***	30

表5 515 bp扩增片段的反应体系

^*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+5) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

^**反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+N个待测样TS）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

^***加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下表为参考板位：

82 bp

133 bp

227 bp

515 bp

Std1

Std2

Std3

Std4

Std5

NCS

NTC

表6 上机参考板位

该示例是对HEK293残留DNA各扩增片段分析的qPCR法检测操作的展示，检测样本均包括：5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线、1个待测样本TS、1个阴性质控NCS、1个无模板对照NTC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2）针对四种不同长度扩增片段创建新检测探针，分别命名为“HEK293-82”、“HEK293-133”、“HEK293-227”、“HEK293-515”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“none”；检测参比荧光为“ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（含义为每孔的DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“Sample Name”一栏中命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4）扩增程序设置：设置三步法扩增程序，反应体积30 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
污染消化	37℃	5 min	1
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	45
退火	60℃	30 sec
延伸（收集荧光）	72℃	30 sec

表7 扩增程序

7. qPCR结果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的标曲：R²＞0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS，单位为fg/μL，后续可在检测报告中进行单位换算。

4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

5）阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

6）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。

Ver.CN20230515