MolPure^® Plasmid Mini Kit 采用 MolPure^® DNA Column P3 和新型的溶液体系，使用常规碱裂解法分离质粒 DNA。提取过程中不需要用到有毒的酚氯仿等有机物抽提，也不需要用到耗时的异丙醇或乙醇沉淀。试剂盒内的 MolPure^® DNA Column P3 可特异性吸附质粒 DNA，不吸附蛋白质、多糖和其它非核酸类物质，具有高效、快速、方便等特点。提取到的质粒 DNA 纯度高，可直接用于后续酶切、转化、测序等实验。

试剂盒组分

类别	编号	组分名称	19001ES08 (5 T)	19001ES50 (50 T)	19001ES70 (200 T)
Part I	19001-A	RNase A (10 mg/mL)	15 µL	125 µL	500 µL
Part II	19001-B	缓冲液 RS*   (RS Buffer P3*)	1.5 mL	12.5 mL	50 mL
	19001-C	缓冲液 AC   (AC Buffer P3)	500 µL	5 mL	20 mL
	19001-D	DNA 吸附柱 P3 (MolPure® DNA Column   P3)	5 个	50 个	200 个
	19001-E	2 mL 收集管 (2 mL Collection Tube P3)	5 个	50 个	200 个
	19001-F	裂解液 LB   (LB Buffer P3)	1.5 mL	12.5 mL	50 mL
	19001-G	结合液 BD   (BD Buffer P3)	1.8 mL	17.5 mL	70 mL
	19001-H	去蛋白液 PL*   (PL Buffer P3* )	1.6 mL	16 mL	63 mL
	19001-I	漂洗液 W*   (Wash Buffer*)	1.3 mL	13 mL	50 mL
	19001-J	洗脱液 (Elution   Buffer)	1 mL	10 mL	20 mL

运输和保存方法

Part I 组分冰袋运输，-20℃保存；Part II 组分常温运输，室温保存。产品有效期 12 个月。

注意事项

1. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

2. 注意观察各溶液是否有析出或浑浊（尤其冬季等室温为低温环境时），可 37℃温浴复溶至溶液澄清，避免影响使用效果。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

4. 本产品仅作科研用途！
 

实验前准备

1.   自备设备和试剂：台式离心机、振荡仪、水浴锅或金属浴，无水乙醇，离心管等。

2.   除特殊指明外，所有的离心步骤均在室温完成，使用可以达到 13,000 rpm 转速的传统台式离心机。

3.   首次使用前，将 RNase A (10 mg/mL) （19001-A）加入缓冲液 RS^*（19001-B）瓶中，充分混匀后使用，并做好标记。每次使用后置于 4℃保存。若长期不用，置于-20℃保存。

4.   首次使用前，漂洗液 W^*（19001-I）和去蛋白液 PL^*（19001-H）需要加入无水乙醇（5T/50T/200T漂洗液 W^*分别加入5.2 mL/52mL/200mL无水乙醇；5T/50T/200T去蛋白液 PL^*分别加入1mL/10mL/40mL无水乙醇），充分混匀后使用，并做好标记。

操作方法

一、样本预处理：

1. 取 1.5-4.5 mL 过夜培养的菌液，12,000 rpm 离心 30 s，弃掉上清液，收集菌体。

【注】：对于低拷贝质粒或＞10 kb 的质粒，建议适当加大菌体量，并等比例增加缓冲液 RS*、裂解液 LB 及结合液 BD 用量。

2. 加入 250 µL 缓冲液 RS^*，吹打或涡旋重悬菌体沉淀。

【注】：确保菌体彻底重悬。

【注】：确保缓冲液 RS^*中已添加 RNase A。

3. 加入 250 µL 裂解液 LB，温和上下翻转 6-8 次以充分裂解菌体，室温放置 4 min。

【注】：此步骤不宜超过 5 min。

【注】：菌体裂解应温和进行，避免造成基因组 DNA 剪切断裂。

【注】：裂解后的菌液应清亮粘稠。若出现浑浊，可能为菌体裂解不彻底，可考虑减少菌体使用量。

4. 加入 350 µL 结合液 BD，立即温和上下翻转 6-8 次充分混匀。室温放置 2 min。13,000 rpm 离心 10 min，小心收集上清。

【注】：加入结合液 BD 后立即混匀，以免出现局部沉淀。

二、质粒 DNA 提取：

1. 向 DNA 吸附柱 P3 中加入 100 µL 缓冲液 AC，13,000 rpm 离心 1 min，弃掉废液。

【注】：处理后的 DNA 吸附柱 P3 仅限当天使用。

2. 将 DNA 吸附柱 P3 套入 2 mL 收集管中，备用。

3. 将上述上清液加入到 DNA 吸附柱 P3 中，12,000 rpm 离心 1 min，弃掉废液。

【注】：混合液每次最大加入体积 700 µL，可分多次离心。

4.（选做） 加入 500 µL 去蛋白液 PL^*，12,000 rpm 离心 1 min，弃废液。

【注】：确保去蛋白液 PL^*已添加无水乙醇。

【注】：此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质。

5.     将 DNA 吸附柱 P3 放回收集管，加入 600 µL 漂洗液 W^*，12,000 rpm 室温离心 30 s，弃废液。

【注】：确保漂洗液 W^*已添加无水乙醇。

6.     重复一遍步骤 5。

7.     将 DNA 吸附柱 P3 放回收集管，空柱 13,000 rpm 室温离心 2 min，以除去残留的漂洗液 W^*。

8.     将 DNA 吸附柱 P3 放入新的 1.5 mL 离心管中（自备），在DNA 吸附柱 P3 中央加入 50-100 µL 洗脱液，室温放置 2 min。然后 12,000 rpm 离心 1 min。收集滤液，即为质粒DNA 溶液。

【注】：可通过以下方式提高回收产量：①70℃预热洗脱液；②将 DNA 滤液再次上柱，室温放置 2 min 后，洗脱。

9.     质粒 DNA 溶液可置于-20℃长期保存。

 

HB220719

 

Q：小提能提多少 ug？

A：起始菌液量 2-6 mL，提取产量 5-35 ug。

Q：质粒小提里面的 RNase A 和 solution1 混合后，说明书建议 4 度存放，放到室温2 天还可以用吗？

A：可以。最好按照标准存放。

Q：质粒小提去蛋白液这一步是不是可以不用吗？还有洗脱液用水行不行？

A：不建议省略去蛋白液；洗脱可以用水。

Q：质粒小提漂洗液含有什么成分？

A：包含 tris，还有其他的不方便透露。

Q: 质粒产量低

A: (1)拷贝数低或者大于10kb的质粒应加大菌体使用量，并按比例增加后续buffer的用量；(2)细菌可能没有充分裂解。 

Q: 裂解液有沉淀

A: 裂解液中含有NaOH，可能盐离子析出，可 37℃温浴复溶至溶液澄清再使用。  

Q：质粒跑胶出现小于100bp的小条带的原因？

A：可能RNA未去除干净（样本太多或者添加了RNase的缓冲液 RS酶活下降）或者裂解时间太长导致质粒受到破坏。

[1] Zhang C, Liu Y, Zhang T, Lv C, Zang J, Zhao G. Structural comparison between the DNA-protective ability of scallop and shrimp ferritin from iron-induced oxidative damage. Food Chem. 2022;386:132827. doi:10.1016/j.foodchem.2022.132827(IF:7.514)
[2] Hei H, Gao J, Dong J, et al. BK Knockout by TALEN-Mediated Gene Targeting in Osteoblasts: KCNMA1 Determines the Proliferation and Differentiation of Osteoblasts. Mol Cells. 2016;39(7):530-535. doi:10.14348/molcells.2016.0033(IF:2.670)